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マイナス水素くん 



珊瑚カルシウムのネズミチフスサルモネラ菌を用いる復帰突然変異試験

要約

 本試験ではネズミチフスサルモネラ菌ヒスチジン栄養欠乏型菌株(his-)を用い、珊瑚カルシウムの変異原性を調ベた。5種類の菌株、即ちTA97、TA98、TA100、TA102 及びTAI535を使った。全てPlate−incorporation法により実施した。代謝活性化及び非活性化をそれぞれ行い、陰性及び陽性の対照を設けた。陰性対照としてジメチルスルホキシド(DMSO)0.1ml/プレートを用いた。 代謝活性化系を使う場合、陽性は対照物質は全て2-aminofluorene(2-AF)20μg/プーレートであり、非代謝活性化系の場合、菌株TA97、TA98及びTA102に対し、陽性対象物質はDexon50μg/プレートであり、菌株TA100及びTA1535に対し、sodium azide (NaN3)3μg/プーレートであった。用量は5000、1667、556、185及び62μg/プレート、計5用量、3回に繰り返した。結果としては、珊瑚カルシウムのネズミチフスサルモネラ菌に対する復帰突然変異試験(Ames Test)においては、各菌株及び各用量群で代謝活性化の有無にかかわらず変異原性が認めらられないことを示した。


1.試験目的

 本試験では、0ECDイヒ学物質試験のガイドラインNo.471(細菌復帰突然変異試験)に準拠し、当所GLP(Good Laboratory Practice)実験条件で,ネズミチフスサルモネラ菌株(his-)を用い、珊瑚カルシウム変異原性(point mutations)の有無について調べ、被験物質の安全性に関するデータを提供することを目的とした。

2.試験材料及び方法

2.1 被験物質
  被験物質は珊瑚カルシウムであり、サンプルの含有量は12%、灰白色の粉末である。

2.2 陽性対照物質
  2-aminofluorene(2-AF)は Fluka Cbemika 会社より、Dexonは丹東農薬会社より、sodium azide (NaN3)は浙江東洋利得医薬化学会社より購入した。
  2-AF と DexonをDMSOの中に溶解させ、NaN3を水の中に溶解させた。

2.3 試験菌株

2.3.1 菌株の種類: ヒスチジン栄養欠乏型ネズミチフスサルモネラ菌株(his-):TA97、TA98、TA100、
    TA102、TA1535。

2.3.2 菌株の由来:上述の菌株は! 1984年にアメリカ合衆国カリフォルニア大学のB.N.Ames 博士から
    分与され、当研究所の実験室で保存していた。

2.3.3 菌株遺伝性状鑑定:ヒスチジン要求性(histidine requirement)、rfa突然変異、uvrb突然変異、R
    因子及び自発復帰突然変異率の試験を行った。遺伝性抗鑑定合格の後、37℃に振とう培養し、
    菌液濃度を1〜3×108/mlこ達させた。

2.4  培地

2.4.1 トップアガ一培地組成


組成成分          毎 500ml
 寒天                3.5 g
 塩化ナトリウム          2.5 g
 蒸留水             500 ml

PH7.2まで調整し30mmol/Lのヒスチジン-ビオチン50mlを加えた。

2.4.2 最少寒天培地組成

組成成分           毎500 ml
 *vogel-Bonner培地E      50 ml
 40%グルコース          150 ml
 2.5%寒天溶液          300 ml

*Vogel-Bonner 培地E
 組成成分                               毎500ml
 リン酸水素カリウム(K2HPO4・3H2O)               81g
 リン酸水素アンモニウムナトリウム(NaNH4HPO4・4H20)  17.5g
 クエン酸(C6H8O7・H2O)                      10g
 硫酸フグネシゥふ(MgSO4・7H2O)                  1g
 蒸留水                                  最終体積500 ml までに加える

2.5  S-9 mix 調製

組成成分           毎 1 ml
 **S-9 0.1 ml
 NADP 4μmol
 D-グルコース-6-リン酸    5μmol
 塩化カリウム         3.3μmol
 塩化マグネシュウム      8μmol
 リン酸塩緩衝液(pH 7.4)  100μmoll
   **7週齢のSprague-Dawley系雄ラットにAroclor1254で誘導し、5日間後動物を屠殺し、
    屠殺前に1日間絶食させた。無菌で肝組織を取り出しS-9を作成した。

2.6 用量設定
 電子天秤でサンプルを測り、DMSOで 5000、1667、556、185及び 62μg/プレート用量のサンプル溶液を調整し試験に使われた。

2.7 操作方法
 標準Ames法、Plate-incorporation 試験を使用した。

2.7.1 非活性化Plate-incorporayion 試験:45℃に保温している溶けた上層培地 2ml 入った試験管の中に順次に被験物質調整液或いは陽性対照物質調整液0.1ml、菌液0.1mlを加え、均一させ、速やかに最少培地に入れ、均一に分布させ、上層培地が固まった後、プレートを反転し、37℃に48時間培養してから各プレートの復帰突然変異コロニー数を数えた。5用量で3回繰り返し、陰性対照 DMSO 0.1ml/プレート、陽性対照 Dexon 50μg/プレート或いは NaN3 3μg/プレートを同様に設けた。

2.7.2活性化Plate-incorporation 試験:45℃に保温している融けた上層培地2ml入った試験管の中に順次
に被験物質調製液或いは陽性対照物質調製液 0.1ml、菌液O、1ml 、 S-9mix 0.33mlを加え、均一させ、速
やかに最少培地に入れ、均一に分布させ、上層培地が固まった後、プレートを反転し, 37℃に48時間
培養してから各プレートの復帰突然変異コロ二一数を数えた。 5用量で、3回繰り返し、陰性対照 DMSO
0.1ml/プレート、陽性対照 2-AF 20μg /プレートを同様に設けた。

2.8 分析方法
 各プレートの復帰突然変異コロニー数を数え、繰り返しの3回の平均値を計算した。陰性対照の2倍
より高いのは陽性結果と判断した。

3.結果及び結論

3.1 細菌復帰突然変異結果
  Table 1 と Figure 1 に示した。

3.2 結論
 OECD化学物質試験のガイドライン(No.471)の試験評価標準により、本試験の結果は、本試験の
条件で珊瑚カルシウムの各用量群は代謝活性化の有無にかかわらず各菌株に対して、変異原性が認めら
れないことを示した。

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